肺部真菌感染的诊断方法及进展
2017.07.26点击：
引言：近年来,随着人口老龄化、器官移植免疫抑制剂的使用、肿瘤放化疗、造血干细胞移植、超广谱抗生素和多种抗生素联合使用、皮质类固醇激素的应用以及各种导管介入治疗等，侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的发病率逐年上升,在入住ICU的重症病人以及低体重第新生儿患者中，侵袭性念珠菌病尤其多见,其中又以侵袭性肺部真菌感染( invasive pulmonary fungal infection, IPFI)最常见,大约占50%～60%。更由于肺部真菌感染临床表现常无特异性,早期诊断困难,病情易被原发病掩盖,造成误诊、漏诊,而延误治疗，未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30% ～80%[1]。因此正确而及时的判断肺部真菌感染是当前临床上迫切需要解决的问题。特对真菌的诊断现状及进展进行综述，以期早期识别肺部真菌感染，近早改善患者的预后。
（一）、肺部真菌感染的诊断现状
随着医疗技术的发展，真菌感染成为日益严重的临床问题。真菌是肺部感染的常见病原体，肺部真菌感染占内脏感染的首位[2 ]。目前在临床实践中肺部真菌感染的诊断仍存在许多难题，在一定程度上可以说其诊断难度远远超过肺部细菌感染的诊断，集中表现在以下几个方面[3]：
1、肺部真菌感染的临床症状、体征和影像学表现大多缺少特征性，更无诊断特异性。其临床表现往往被严重的基础疾病或治疗药物如免疫抑制剂、激素所掩盖，易被漏诊、误诊。
2、继发性肺部真菌感染常常是细菌感染不适当应用广谱抗生素引发的结果，呈现双重感染或复合感染，临床病情严重，常规标本的实验室检查很难揭示所有致病微生物，容易导致处理上的偏颇或顾此失彼。
3、条件致病性真菌，如念珠菌、曲菌等是上呼吸道的常居菌。咳痰标本极易遭受污染。通常的咳痰标本，甚至经纤维支气管镜吸引标本分离的此类真菌也很难确定其病原性。诊断标本采集成为临床上首先遇到的一大难题。
因此，如何提高医务工作者对真菌感染的警惕性，掌握肺部真菌感染的临床表现、影像学特点以及可靠的实验室诊断方法为当务之急。
（二）、肺部真菌感染的诊断方法
传统的肺部真菌感染的诊断主要依据临床、真菌学检查和组织病理三者的结合，近20年新的实验室检查方法和CT影像的结合，提高了真菌感染的早期诊断及阳性率。
1、临床诊断
⑴病史采集：临床诊断询问病史至关重要，也是诊断肺部感染的重要线索和依据，特别注意询问以下几点：基础病；诱发因素；其他病史：职业史、旅行史和接触史对肺部感染的诊断也非常重要。
⑵症状和体征：体温与症状分离现象，即病人感觉良好，不觉发热等特殊不适，但测体温可在38℃以上。常见一些非特异性症状、体征：如发热、咳嗽、咳痰、胸痛、血痰或咯血、胸闷、呼吸困难等。肺部体检可闻及干湿性啰音，有时有肺实变征或胸腔积液征。
⑶肺部真菌感染的影像学：肺部真菌感染影像学改变通常也无特异性。目前,国内外多数学者就典型的影像学改变已达成共识,并将其分为以下几种类型: ①肺炎型；②肿块型；③曲霉菌球；④胸膜炎；⑤粟粒型。
2、真菌学检查：
⑴直接检查
标本采集：呼吸道真菌感染的主要临床标本来源：咳痰、支气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、支气管镜吸取物、活检肺组织。亦可根据肺部真菌感染的类型不同，选择血、骨髓、胸水、脑脊液等非呼吸道标本协助本病的诊断。其他方法：经环甲膜穿刺、经皮肺穿刺抽吸肺组织检查、开胸肺活检均有较高的诊断价值，但均为有创，病人难以接受，重症病人难以耐受。
⑵培养检查
本法可确定菌种，辅助直接检查不足，通常用沙堡氏培养基（22～28℃），深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养，或根据不同菌种运用不同培养基，培养过程中应每天观察，至少每周2次，通过菌落外观、显微镜下结构、生理生化特性测定鉴别菌种。
致病性真菌培养阳性即可确诊。条件致病菌则不然，因为它们可以是人体的正常菌群，应视标本的来源来决定真菌培养的价值，若标本来源于无菌的闭腔体液或组织则可认为其为病原菌，但若是从痰、咽拭子等有菌的标本中找到条件致病菌，且菌落数量较多时才能认为是病原菌。真菌培养的确可为临床提供最为直接的诊断依据，但培养方法耗时长，早期培养阳性率甚低，不适宜用作早期诊断，晚期则多已失去治疗时机。
直接检查和培养检查的关系：临床最易获得的标本是自然经口咳出的痰标本,痰涂片检查操作简便、快速，尤其是查见大量孢子及菌丝时，表明真菌在机体内生长繁殖较快，当肺部内出现较多真菌孢子及菌丝时可堵塞相应支气管并出现相关的临床体征。痰直接涂片找真菌对临床快速确定下呼吸道真菌感染具有重要意义[4]，李俊如[5]等在一篇“呼吸道分泌物真菌直接涂片检查的临床准确性探讨”的研究中指出：确诊呼吸道真菌感染患者的“涂阳”率为0.418(301／720)，其临床准确性指标——灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别为0.418、0.992、0.984、0.596、0.684；“无呼吸道炎症人群”口咽部真菌直接涂片的阳性概率为0．008(5／622)，其中≥50岁组为0.013(3／234)均为念珠菌，数量均为“少量”。结论：痰液真菌直接涂片检查的灵敏度低而特异度高。排除误判的“涂阳”，宜视为临床感染或亚临床隐性感染，不宜视为正常携带；若其数量大于“少量”，则诊断意义更大；“涂阴”无否定意义。
提示临床送检呼吸道标本作真菌培养及鉴定时应同时作真菌涂片镜检。
⑶组织病理学检查[6]
肺部真菌病，无论从“深部”和“病”这两点来理解，都需要从组织学上证明真菌侵犯及其形成的炎症损害。标本由以下途径获取：
①经支气管肺活组织检查：对肺部弥漫性病变、免疫功能损害患者的诊断阳性率较高。结合刷检、灌洗诊断阳性率则较高。
②经胸壁穿刺肺活组织检查对弥漫性肺部病变活检的总体阳性率约40%。
③开胸肺活检阳性率（69%）较支气管肺活检（52%）明显升高。
这三种方法均为有创方法，费时且影响因素较多，与所取标本的多少、肺部病变的部位、宿主免疫功能状态、检查医师的技术水平、标本的处理方法以及病理科医师的诊断经验有关。有时尚不足以完全准确鉴别菌种和菌型。需同时将活检标本分割出小部分做真菌培养，最终作出正确鉴定。
⑷血清学检查
近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。有烯醇化酶、beta葡聚耱、甘露糖和Cand-Tec抗原等[7]。目前临床上使用的的血清学检查主要针对曲霉菌细胞壁成分-半乳甘露聚糖抗原（Galactomannan，GM）和针对曲霉菌和念珠菌属的1，3-β-D-葡聚糖（G试验）的检测，是诊断侵袭性真菌感染微生物学检查依据之一，这两项检查已被美国FDA和欧洲许多国家批准用于血液、肿瘤等免疫受损者中侵袭性真菌感染的诊断[8]。
葡聚糖[9]广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%—90%，其中(1- 3)- β-D葡聚糖（(1-3) - beta D glucan，BG）占真菌胞壁成分50% 以上，尤其在酵母样真菌中其含量可更高，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后。BG可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液(如尿，脑脊液，腹水，胸水等)中BG含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除BG，而在浅部真菌感染中，BG未被释放出来，故其在体液中含量不增高,有研究提示[10，11]，真菌在口腔、尿路、支气管的定植并不会导致血浆葡聚糖升高到20pg/ml以上。20世纪90年代初发现，BG可特异性激活从鲎变形细胞溶解产物提取的G 因子，从而旁路激活鲎试验，此过程称为G试验。临床上，由干深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致，故可将G试验用于深部真菌感染的诊断（包括念珠菌和曲霉菌），其缺点是不能定性，且此法不能检测出隐球菌感染，可能是因为隐球菌具有厚壁胞膜，且在免疫缺陷患者体内生长缓慢，导致试验呈假阴性。目前有很多研究证实在某些物质中存在BG类似物，造成了假阳性结果[12-14]如：① 中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪(人工肾，血液透析仪)洗涤液。②纱布棉球等实验室污染。③ 抗肿瘤药物中蘑菇聚糖，K多聚糖等成分也含有BG类似物。④ 化疗或放疗引起的黏膜炎症，使得食物中BG可以通过受损的胃肠道黏膜进入到血液中。⑤ 以真菌作为原料制成的抗生素。⑥ 某些细菌感染患者。Pazos[15]等研究发现1例大肠埃希菌感染者BG为阳性，大于120 pg/ml，但是对于BG动态检测可以有效排除这种假阳性。Mitsutake[16]等研究显示， BG的特异性和敏感性为84.4%和87.5%。。Verweij PE[17]等报道的BG特异性和敏感性均大于80%。国内吕沛华[18]等报道1，3-β-D-葡聚糖在肺部真菌感染中以20pg/ml为诊断阈值(Cut-off)的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为：85％、93％、86％和88％。
现有的曲霉菌半乳甘露聚糖的检测使用的是Platelia ELISA试剂盒，尽管许多研究表明这个真菌细胞壁标志物对诊断侵袭性曲霉菌感染有很好的特异性，但敏感性波动较大，从17% 到 100%不等[19,20]。另一个决定曲霉菌抗原检测阳性率的主要是不同人群的发病情况。这已经在近期的一个用GM诊断侵袭性曲霉菌病的Meta分析中得到很好的证明[21]。如果发病率从5%提高到20%，则本试验的阳性预测值从31%提高到69%。相应的，如果试验前估计侵袭性曲霉菌病发病率较低，那么将曲霉菌抗原检测试验作为筛选试验是不可能获益的或者说成本效益分析是不合理的。应该观察高危人群，包括异基因干细胞移植、急性髓性白血病和处于强化化疗阶段的复发病人。为了提高敏感性，需要连续检测，同时假阳性也可能发生，特别在使用哌拉西林他唑巴坦人群中[22]。
⑸分子生物学检查
分子扩增技术（PCR聚合酶链反应和NASBA核酸系列依赖的扩增)有提高诊断率的潜力，但缺乏标准且没有形成完整的评价系统，故PCR检测方法没有包括在EORTC/MSG标准中[23]。完成这项试验需要很多因素:如样本类型、分子目标、扩增平台、扩增子的检测[ 24]，包括核酸扩增技术本身在内,需得到许多国际组织一致同意[ 25,26]，否则不能作为被推荐的标准。目前尚处于实验室应用阶段，即更多的是应用于真菌的分型，如白念珠菌、曲霉、组织胞浆菌、卡氏虫肺孢子等，其临床诊断价值还有待进一步研究。
⑹影像学
侵袭性曲霉菌感染的X线表现常常没有特异性且出现较晚，段、亚段实变，不规则浸润，单一或多发结节，结节性浸润，空洞形成均可出现，但在早期诊断侵袭性真菌感染中的价值有限，CT能发现早期阶段的病变。典型的空洞征和巨大结节认为是侵袭性曲霉菌不断进展，向实变（经常波及胸膜）、梗死、空洞发展的早期征象。基于早期CT影像表现的抗真菌治疗能提高患者的生存率[27]。
空洞征在糖皮质激素治疗的非中性粒细胞减少的病人中不如中性粒细胞减少的病人中敏感[28]，可能反应了降低真菌负荷的炎症反应不同，在非中性粒细胞减少的肺部炎症细胞转运增加。这也许影响抗原检查的应用，可能解释了在不同人群中敏感性的差异[29]。
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（一）、肺部真菌感染的诊断现状
随着医疗技术的发展，真菌感染成为日益严重的临床问题。真菌是肺部感染的常见病原体，肺部真菌感染占内脏感染的首位[2 ]。目前在临床实践中肺部真菌感染的诊断仍存在许多难题，在一定程度上可以说其诊断难度远远超过肺部细菌感染的诊断，集中表现在以下几个方面[3]：
1、肺部真菌感染的临床症状、体征和影像学表现大多缺少特征性，更无诊断特异性。其临床表现往往被严重的基础疾病或治疗药物如免疫抑制剂、激素所掩盖，易被漏诊、误诊。
2、继发性肺部真菌感染常常是细菌感染不适当应用广谱抗生素引发的结果，呈现双重感染或复合感染，临床病情严重，常规标本的实验室检查很难揭示所有致病微生物，容易导致处理上的偏颇或顾此失彼。
3、条件致病性真菌，如念珠菌、曲菌等是上呼吸道的常居菌。咳痰标本极易遭受污染。通常的咳痰标本，甚至经纤维支气管镜吸引标本分离的此类真菌也很难确定其病原性。诊断标本采集成为临床上首先遇到的一大难题。
因此，如何提高医务工作者对真菌感染的警惕性，掌握肺部真菌感染的临床表现、影像学特点以及可靠的实验室诊断方法为当务之急。
（二）、肺部真菌感染的诊断方法
传统的肺部真菌感染的诊断主要依据临床、真菌学检查和组织病理三者的结合，近20年新的实验室检查方法和CT影像的结合，提高了真菌感染的早期诊断及阳性率。
1、临床诊断
⑴病史采集：临床诊断询问病史至关重要，也是诊断肺部感染的重要线索和依据，特别注意询问以下几点：基础病；诱发因素；其他病史：职业史、旅行史和接触史对肺部感染的诊断也非常重要。
⑵症状和体征：体温与症状分离现象，即病人感觉良好，不觉发热等特殊不适，但测体温可在38℃以上。常见一些非特异性症状、体征：如发热、咳嗽、咳痰、胸痛、血痰或咯血、胸闷、呼吸困难等。肺部体检可闻及干湿性啰音，有时有肺实变征或胸腔积液征。
⑶肺部真菌感染的影像学：肺部真菌感染影像学改变通常也无特异性。目前,国内外多数学者就典型的影像学改变已达成共识,并将其分为以下几种类型: ①肺炎型；②肿块型；③曲霉菌球；④胸膜炎；⑤粟粒型。
2、真菌学检查：
⑴直接检查
标本采集：呼吸道真菌感染的主要临床标本来源：咳痰、支气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、支气管镜吸取物、活检肺组织。亦可根据肺部真菌感染的类型不同，选择血、骨髓、胸水、脑脊液等非呼吸道标本协助本病的诊断。其他方法：经环甲膜穿刺、经皮肺穿刺抽吸肺组织检查、开胸肺活检均有较高的诊断价值，但均为有创，病人难以接受，重症病人难以耐受。
⑵培养检查
本法可确定菌种，辅助直接检查不足，通常用沙堡氏培养基（22～28℃），深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养，或根据不同菌种运用不同培养基，培养过程中应每天观察，至少每周2次，通过菌落外观、显微镜下结构、生理生化特性测定鉴别菌种。
致病性真菌培养阳性即可确诊。条件致病菌则不然，因为它们可以是人体的正常菌群，应视标本的来源来决定真菌培养的价值，若标本来源于无菌的闭腔体液或组织则可认为其为病原菌，但若是从痰、咽拭子等有菌的标本中找到条件致病菌，且菌落数量较多时才能认为是病原菌。真菌培养的确可为临床提供最为直接的诊断依据，但培养方法耗时长，早期培养阳性率甚低，不适宜用作早期诊断，晚期则多已失去治疗时机。
直接检查和培养检查的关系：临床最易获得的标本是自然经口咳出的痰标本,痰涂片检查操作简便、快速，尤其是查见大量孢子及菌丝时，表明真菌在机体内生长繁殖较快，当肺部内出现较多真菌孢子及菌丝时可堵塞相应支气管并出现相关的临床体征。痰直接涂片找真菌对临床快速确定下呼吸道真菌感染具有重要意义[4]，李俊如[5]等在一篇“呼吸道分泌物真菌直接涂片检查的临床准确性探讨”的研究中指出：确诊呼吸道真菌感染患者的“涂阳”率为0.418(301／720)，其临床准确性指标——灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别为0.418、0.992、0.984、0.596、0.684；“无呼吸道炎症人群”口咽部真菌直接涂片的阳性概率为0．008(5／622)，其中≥50岁组为0.013(3／234)均为念珠菌，数量均为“少量”。结论：痰液真菌直接涂片检查的灵敏度低而特异度高。排除误判的“涂阳”，宜视为临床感染或亚临床隐性感染，不宜视为正常携带；若其数量大于“少量”，则诊断意义更大；“涂阴”无否定意义。
提示临床送检呼吸道标本作真菌培养及鉴定时应同时作真菌涂片镜检。
⑶组织病理学检查[6]
肺部真菌病，无论从“深部”和“病”这两点来理解，都需要从组织学上证明真菌侵犯及其形成的炎症损害。标本由以下途径获取：
①经支气管肺活组织检查：对肺部弥漫性病变、免疫功能损害患者的诊断阳性率较高。结合刷检、灌洗诊断阳性率则较高。
②经胸壁穿刺肺活组织检查对弥漫性肺部病变活检的总体阳性率约40%。
③开胸肺活检阳性率（69%）较支气管肺活检（52%）明显升高。
这三种方法均为有创方法，费时且影响因素较多，与所取标本的多少、肺部病变的部位、宿主免疫功能状态、检查医师的技术水平、标本的处理方法以及病理科医师的诊断经验有关。有时尚不足以完全准确鉴别菌种和菌型。需同时将活检标本分割出小部分做真菌培养，最终作出正确鉴定。
⑷血清学检查
近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。有烯醇化酶、beta葡聚耱、甘露糖和Cand-Tec抗原等[7]。目前临床上使用的的血清学检查主要针对曲霉菌细胞壁成分-半乳甘露聚糖抗原（Galactomannan，GM）和针对曲霉菌和念珠菌属的1，3-β-D-葡聚糖（G试验）的检测，是诊断侵袭性真菌感染微生物学检查依据之一，这两项检查已被美国FDA和欧洲许多国家批准用于血液、肿瘤等免疫受损者中侵袭性真菌感染的诊断[8]。
葡聚糖[9]广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%—90%，其中(1- 3)- β-D葡聚糖（(1-3) - beta D glucan，BG）占真菌胞壁成分50% 以上，尤其在酵母样真菌中其含量可更高，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后。BG可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液(如尿，脑脊液，腹水，胸水等)中BG含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除BG，而在浅部真菌感染中，BG未被释放出来，故其在体液中含量不增高,有研究提示[10，11]，真菌在口腔、尿路、支气管的定植并不会导致血浆葡聚糖升高到20pg/ml以上。20世纪90年代初发现，BG可特异性激活从鲎变形细胞溶解产物提取的G 因子，从而旁路激活鲎试验，此过程称为G试验。临床上，由干深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致，故可将G试验用于深部真菌感染的诊断（包括念珠菌和曲霉菌），其缺点是不能定性，且此法不能检测出隐球菌感染，可能是因为隐球菌具有厚壁胞膜，且在免疫缺陷患者体内生长缓慢，导致试验呈假阴性。目前有很多研究证实在某些物质中存在BG类似物，造成了假阳性结果[12-14]如：① 中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪(人工肾，血液透析仪)洗涤液。②纱布棉球等实验室污染。③ 抗肿瘤药物中蘑菇聚糖，K多聚糖等成分也含有BG类似物。④ 化疗或放疗引起的黏膜炎症，使得食物中BG可以通过受损的胃肠道黏膜进入到血液中。⑤ 以真菌作为原料制成的抗生素。⑥ 某些细菌感染患者。Pazos[15]等研究发现1例大肠埃希菌感染者BG为阳性，大于120 pg/ml，但是对于BG动态检测可以有效排除这种假阳性。Mitsutake[16]等研究显示， BG的特异性和敏感性为84.4%和87.5%。。Verweij PE[17]等报道的BG特异性和敏感性均大于80%。国内吕沛华[18]等报道1，3-β-D-葡聚糖在肺部真菌感染中以20pg/ml为诊断阈值(Cut-off)的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为：85％、93％、86％和88％。
现有的曲霉菌半乳甘露聚糖的检测使用的是Platelia ELISA试剂盒，尽管许多研究表明这个真菌细胞壁标志物对诊断侵袭性曲霉菌感染有很好的特异性，但敏感性波动较大，从17% 到 100%不等[19,20]。另一个决定曲霉菌抗原检测阳性率的主要是不同人群的发病情况。这已经在近期的一个用GM诊断侵袭性曲霉菌病的Meta分析中得到很好的证明[21]。如果发病率从5%提高到20%，则本试验的阳性预测值从31%提高到69%。相应的，如果试验前估计侵袭性曲霉菌病发病率较低，那么将曲霉菌抗原检测试验作为筛选试验是不可能获益的或者说成本效益分析是不合理的。应该观察高危人群，包括异基因干细胞移植、急性髓性白血病和处于强化化疗阶段的复发病人。为了提高敏感性，需要连续检测，同时假阳性也可能发生，特别在使用哌拉西林他唑巴坦人群中[22]。
⑸分子生物学检查
分子扩增技术（PCR聚合酶链反应和NASBA核酸系列依赖的扩增)有提高诊断率的潜力，但缺乏标准且没有形成完整的评价系统，故PCR检测方法没有包括在EORTC/MSG标准中[23]。完成这项试验需要很多因素:如样本类型、分子目标、扩增平台、扩增子的检测[ 24]，包括核酸扩增技术本身在内,需得到许多国际组织一致同意[ 25,26]，否则不能作为被推荐的标准。目前尚处于实验室应用阶段，即更多的是应用于真菌的分型，如白念珠菌、曲霉、组织胞浆菌、卡氏虫肺孢子等，其临床诊断价值还有待进一步研究。
⑹影像学
侵袭性曲霉菌感染的X线表现常常没有特异性且出现较晚，段、亚段实变，不规则浸润，单一或多发结节，结节性浸润，空洞形成均可出现，但在早期诊断侵袭性真菌感染中的价值有限，CT能发现早期阶段的病变。典型的空洞征和巨大结节认为是侵袭性曲霉菌不断进展，向实变（经常波及胸膜）、梗死、空洞发展的早期征象。基于早期CT影像表现的抗真菌治疗能提高患者的生存率[27]。
空洞征在糖皮质激素治疗的非中性粒细胞减少的病人中不如中性粒细胞减少的病人中敏感[28]，可能反应了降低真菌负荷的炎症反应不同，在非中性粒细胞减少的肺部炎症细胞转运增加。这也许影响抗原检查的应用，可能解释了在不同人群中敏感性的差异[29]。
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